See blogipostitus uurib, kuidas kolmanda põlvkonna sekveneerimine, ületades olemasolevate tehnoloogiate piirangud, võimaldab kiiret ja täpset personaalse genoomi sekveneerimist ning on ajendanud nihet personaalse ja ennustava meditsiini poole.
Inimese sünd algab hetkel, mil viljastatud munarakk pärast sperma ja munaraku ühinemist alustab jagunemist. Rakkude jagunemisel nende arv järk-järgult suureneb. Iga rakk diferentseerub, et täita erinevaid funktsioone, kasvades lõpuks terviklikuks organismiks, mis võimaldab meil praegust elutegevust. Selles etapis määrab geenide abil, millist funktsiooni iga rakk täidab. Need geenid on talletatud DNA-s, geneetilises materjalis, mis kodeerib teavet spetsiifiliste nelja nukleotiidi korduvate järjestuste kaudu. Teadlased on püüdnud seda nukleotiidjärjestust täpselt kaardistada, mille tulemuseks oli inimese genoomi projekt (HGP), mille eesmärk oli dekodeerida kogu inimese DNA järjestus. Arvestades tolleaegseid tehnoloogilisi võimalusi, võttis selle ulatusliku projekti lõpuleviimine kaua aega – 13 aastat. Selle põhjuseks oli asjaolu, et hoolimata sellest, et inimese DNA koosnes umbes 3 miljardist aluspaarist, suutis tollal saadaolev tehnoloogia lugeda korraga vaid lühikesi, umbes 300 aluspaari pikkuseid lõike. Lõppkokkuvõttes nõudis see keerulist protsessi: DNA lõikamist lugematuteks fragmentideks, iga fragmendi replikeerimist selle järjestuse analüüsimiseks ja seejärel nende fragmentide kokkupanemist üheks pidevaks järjestuseks.
HGP 13-aastase kestuse jooksul kerkis pidevalt esile vajadus kiiremate ja tõhusamate sekveneerimismeetodite järele ning selle nõudluse rahuldamiseks tehtud uuringud jätkusid vaibumatult. Selle tulemusena töötati välja mitmesuguseid täiustatud tehnikaid. Kiiruse suurendamiseks tehti jõupingutusi DNA replikatsiooniks kuluva aja vähendamise või seadmete efektiivsuse parandamise teel, säilitades samal ajal põhilise eksperimentaalse lähenemisviisi. Ainuüksi neil täiustustel olid aga piirangud alusjärjestuse analüüsiks kuluva aja dramaatilisel vähendamisel. Lõppkokkuvõttes oli vajalik eksperimentaalse meetodi enda põhimõtteline muutmine.
Selle nõudluse keskel tutvustati esimesena järgmise põlvkonna sekveneerimismeetodit (NGS). Kuigi NGS-il on tavapäraste meetoditega sarnane alusjärjestuste lugemise põhimõte, lühendas see oluliselt analüüsiaega, jagades DNA lühemateks fragmentideks ja kasutades nende fragmentide samaaegseks lugemiseks suuremahulist paralleelset töötlemise lähenemisviisi. See tehnoloogia sai võimalikuks tänu arvutusvõimsuse dramaatilisele paranemisele, kuid sellel oli ka piirang, kuna see säilitas osaliselt pikad eeltöötlusetapid ja kõrge veamäära, mis olid olemasolevate analüüsimeetodite puudused. Sel põhjusel töötatakse nüüd välja tehnoloogiaid, mis kasutavad tavapärastest meetoditest täiesti erinevaid põhimõtteid, võimaldades pikkade alusjärjestuste kiiret ja väga täpset lugemist ühe läbimisega. Neid tehnoloogiaid nimetatakse kolmanda põlvkonna sekveneerimismeetoditeks ja neid nimetatakse ühiselt üksikmolekuli reaalajas sekveneerimiseks (SMRT).
Praegu väljatöötamisel olev SMRT-tehnoloogia jaguneb laias laastus neljaks peamiseks lähenemisviisiks. Esimene meetod kasutab fluorestsentsmärgistatud aluste seondumisel DNA sünteesi ajal tekkivat väikest luminestsentsi. Tavaliselt hajub keemiliste reaktsioonide käigus kiirgav valgus mitmes suunas, mistõttu on väikesemahuliste reaktsioonide käigus tekkivate nõrkade signaalide tuvastamine keeruline. Nullrežiimi lainejuhi kasutamine aga piirab valgust nii, et see ei saa lainejuhis levida ja kiirgub ainult kindlas suunas. See võimaldab sama valgushulgaga palju tõhusamat signaali püüdmist. Järelikult, DNA sünteesi eest vastutava polümeraasi immobiliseerimisega lainejuhi alumisele pinnale ja fluorestsentsmärgistatud aluste reaalajas sünteesi võimaldamisega on võimalik analüüsida alusjärjestust, kasutades ainult üheahelalise DNA sünteesiprotsessi käigus tekkinud nõrka luminestsentsi. See meetod tugineb luminestsentssignaalidele, seega on vigade tekkimise tõenäosus tuvastusseadmes suhteliselt suur. Need vead ei ole aga süstemaatilised vead kindla suunaga; need vastavad juhuslikele vigadele, mida saab statistiliselt korrigeerida korduvate mõõtmiste abil. Lisaks võimaldab selle paralleelsuse lihtsus ulatuslikku samaaegset analüüsi, mis võimaldab väga kiiret alusjärjestuse lugemiskiirust.
Teine meetod hõlmab DNA molekulide fikseerimist ja seejärel elektronide tunneldamist läbi nende, et mõõta aluse tüübile vastavat tunnelenergia spektrit, sarnaselt skaneerivates tunnelmikroskoopides kasutatavale põhimõttele. See tehnoloogia ei vaja DNA replikatsiooniprotsessi, võimaldades lugeda korraga väga pikki ahelaid ühemolekuli olekus. See ei vaja ka peaaegu mingit eeltöötlust, mis teoreetiliselt lubab analüüsikulude olulist vähenemist. Siiski peetakse täiemahulise uurimistöö aktiivset jätkamist veel ennatlikuks, kuna piisavat tehnilist täpsust ja stabiilsust pole veel saavutatud ning arvukalt väljakutseid on endiselt lahendamata, sealhulgas elektroonilise müra lahendamine ja seadmete reprodutseeritavuse tagamine.
Kolmas meetod hõlmab membraanipotentsiaali mõõtmist, mis varieerub sõltuvalt alustüübist, kui DNA üksikahel läbib mikroobset membraanivalku. Pärast DNA kaksikahela eraldamist üheks ahelaks põhjustab selle läbimine membraanivalku sisaldavast nanopoorist igas aluses veidi erinevaid elektrilisi muutusi. Need muundatakse täpseteks elektrilisteks signaalideks alusjärjestuse tõlgendamiseks. See tehnoloogia pakub lihtsa struktuuri eelist, mis hõlbustab seadmete miniaturiseerimist. Nagu teine meetod, suudab see pikki DNA ahelaid pidevalt lugeda, kuna see ei vaja replikatsiooni. Praegu käib aktiivne uurimistöö analüütilise täpsuse suurendamiseks, kasutades erinevaid keskkondi või katalüsaatoreid, et kontrollida DNA valgu nanopoori läbimise kiirust.
Viimane meetod hõlmab iga aluse poolt genereeritud unikaalsete elektriliste signaalide mõõtmist, kui DNA läbib äärmiselt kitsast poori, mis koosneb juhist ja dielektrikust, et määrata alusjärjestus. See erineb kolmandast meetodist, mis kasutab mikroobseid membraanvalke, selle poolest, et see kasutab pooljuhtpõhist tahket nanopoori. Pooljuhtseadmete kasutamist hinnatakse tehnoloogiana, millel on potentsiaal pakkuda suurimat konkurentsivõimet kiiruse ja kulude osas, kuna see tagab struktuurilise stabiilsuse ja hõlbustab masstootmist. Selle rakendamine reaalsetes seadmetes seisab aga silmitsi arvukate tehniliste väljakutsetega, mis tuleb lahendada, näiteks suurenenud signaalimüra, pooride suuruse muutustest tingitud mõõtmishälbed ja raskused DNA liikumiskiiruse kontrollimisel. Seetõttu on enne praktilise rakenduse etappi jõudmist endiselt olulisi takistusi.
Seega on pideva tehnoloogia arengu ja edasimineku kaudu alusjärjestuse analüüsiks kuluv aeg ja kulud järk-järgult vähenenud. See tähendab, et alusjärjestuse analüüsi tehnoloogia, mida varem kasutati üksnes teadusuuringute eesmärgil, on nüüd järk-järgult muutumas kättesaadavaks tavainimeste igapäevaelule lähedasel tasemel. Tänapäeval laialdaselt rakendatav geneetiline testimine tervisekontrollides on suurepärane näide, mis võimaldab alusjärjestusi analüüsides ligikaudselt hinnata selliste haiguste nagu vähk tekke tõenäosust. Kõige tuntum näide on Angelina Jolie juhtum 2013. aastal, kus talle tehti ennetav mastektoomia pärast seda, kui ta sai genoomianalüüsi abil teada, et tal on väga suur tõenäosus rinnavähi tekkeks. Lisaks on kiire DNA sekveneerimise tehnoloogia oluline ka haruldaste geneetiliste haiguste uurimisel. Geneetiliste haiguste uurimiseks DNA järjestuse tasandil on vaja saada ja analüüsida ulatuslikku DNA järjestuse teavet mitte ainult patsiendilt endalt, vaid ka tema lähedastelt sugulastelt. Kui ühe inimese DNA sekveneerimine oleks võtnud üle kümne aasta, nagu see tehti inimgenoomi projekti ajastul, oleks selline uuring algusest peale võimatu olnud.
Lisaks pakub DNA sekveneerimine potentsiaali mitmekesisteks rakendusteks peale uuringute, ulatudes igapäevaellu. Näiteks idufirma 23andMe analüüsib klientide DNA-d süljeproovide abil, pakkudes põhiteavet tervise kohta, näiteks haruldaste haiguste kandja staatust või teatud geneetiliste häirete tekkimise tõenäosust. Samal ajal pakub see andmeid selle kohta, kui tihedalt on inimese esivanemad seotud erinevate etniliste rühmadega. Rassiliselt mitmekesises Ameerika ühiskonnas äratasid sellised teenused märkimisväärset huvi, mis viis 23andme kiire kasvuni. Nad kogusid lugematute klientide DNA järjestuse teavet ja neid andmeid kasutati oma uurimistöös või edastati teistele uurimisasutustele.
Seni on uuringud keskendunud peamiselt tehnoloogiate väljatöötamisele, mis võimaldaksid DNA järjestusi kiiresti ja täpselt analüüsida, ning selle põhjal tohutu hulga DNA järjestusandmete kogumisele. Nüüdseks on aga kogutud piisavalt proove ja oleme jõudmas tehnoloogilisele tasemele, kus individuaalsel tasemel DNA järjestust saab analüüsida peaaegu reaalajas. Kuigi kiiremad ja täpsemad analüüsimeetodid on endiselt olulised ning nende uurimine ei ole mõttetuks muutunud, on edaspidi kriitilisem ülesanne uurida, kuidas sisukalt kasutada inimeste, loomade ja patogeenide DNA järjestusandmeid, mida saab hõlpsalt ja kiiresti igal ajal ja igal pool hankida. Üks suund võiks olla inimeste huvidele vastavate teenuste, näiteks 23andMe, väljatöötamine. Rakenduspotentsiaal rahvatervises on samuti tohutu, näiteks haiguste tunnuste ja levikumustrite analüüsimine patogeenide mutatsioonide põhjal. On selge, et järjestusanalüüsi tulevikku ei määra mitte ainult tehnoloogilise kiiruse paranemine, vaid ka uued ideed kogunenud andmete uuenduslikuks kasutamiseks.
