פוסט זה בבלוג בוחן כיצד ריצוף דור שלישי, תוך התגברות על המגבלות של טכנולוגיות קיימות, מאפשר ריצוף גנום אישי מהיר ומדויק והוביל את המעבר לרפואה מותאמת אישית וחיזוי.
לידתו של פרט אנושי מתחילה ברגע שבו הביצית המופרית מתחילה להתחלק לאחר שהתא הזרע והביצית מתאחדים. ככל שהתאים מתחלקים, מספרם גדל בהדרגה. כל תא מתמיין כדי לבצע פונקציות שונות, ובסופו של דבר גדל לאורגניזם שלם המאפשר את פעילויות חיינו הנוכחיות. בשלב זה, הפונקציה שכל תא יבצע נקבעת על ידי גנים. גנים אלה מאוחסנים ב-DNA, החומר הגנטי, המקודד מידע באמצעות רצפים חוזרים ספציפיים של ארבעה נוקלאוטידים. מדענים שאפו למפות במדויק את רצף הנוקלאוטידים הזה, שהגיע לשיאו בפרויקט הגנום האנושי (HGP), שמטרתו לפענח את רצף ה-DNA האנושי כולו. בהתחשב ביכולות הטכנולוגיות של התקופה, השלמת הפרויקט העצום הזה ארכה 13 שנים ארוכות. הסיבה לכך הייתה, שלמרות שה-DNA האנושי הורכב מכ-3 מיליארד זוגות בסיסים, הטכנולוגיה שהייתה זמינה אז יכלה לקרוא רק מקטעים קצרים של כ-300 זוגות בסיסים בכל פעם. בסופו של דבר, זה דרש תהליך מורכב: חיתוך ה-DNA לאינספור מקטעים, שכפול כל מקטע כדי לנתח את הרצף שלו, ולאחר מכן הרכבה מחדש של מקטעים אלה לרצף רציף אחד.
לאורך 13 שנות פעילותו של ה-HGP, עלה בהתמדה הצורך בשיטות ריצוף מהירות ויעילות יותר, והמחקר שעמד בדרישה זו נמשך ללא הפוגה. כתוצאה מכך, פותחו טכניקות משופרות שונות. נעשו מאמצים להגביר את המהירות על ידי צמצום הזמן הנדרש לשכפול דנ"א או שיפור יעילות הציוד, תוך שמירה על הגישה הניסויית הבסיסית. עם זאת, לשיפורים אלה לבדם היו מגבלות בהפחתה דרמטית של הזמן הנדרש לניתוח רצפי בסיסים. בסופו של דבר, היה צורך בשינוי מהותי בשיטת הניסוי עצמה.
על רקע דרישה זו, הטכנולוגיה הראשונה שהוצגה הייתה ריצוף הדור הבא (NGS). בעוד של-NGS יש עיקרון דומה לקריאת רצפי בסיסים עם שיטות קונבנציונליות, היא קיצרה משמעותית את זמן הניתוח על ידי חלוקת ה-DNA למקטעים קצרים יותר ושימוש בגישת עיבוד מקבילית בקנה מידה גדול לקריאת מקטעים אלה בו זמנית. טכנולוגיה זו התאפשרה הודות לשיפור הדרמטי בכוח המחשוב, אך היא גם נשאה את המגבלה של שמירה חלקית על שלבי העיבוד המקדים הארוכים ושיעורי השגיאה הגבוהים שהיו חסרונות של שיטות הניתוח הקיימות. מסיבה זו, מפותחות כיום טכנולוגיות המשתמשות בעקרונות שונים לחלוטין משיטות קונבנציונליות, ומאפשרות קריאה מהירה ומדויקת ביותר של רצפי בסיסים ארוכים במעבר אחד. טכנולוגיות אלו מכונות שיטות ריצוף דור שלישי ומכונות יחד ריצוף בזמן אמת של מולקולה בודדת (SMRT).
טכנולוגיית ה-SMRT הנמצאת כעת בפיתוח מסווגת באופן כללי לארבע גישות עיקריות. השיטה הראשונה משתמשת בזרימה הזעירה הנפלטת כאשר בסיסים המסומנים בפלואורסצנטית נקשרים במהלך סינתזת DNA. בדרך כלל, אור הנפלט מתגובות כימיות מתפזר לכיוונים מרובים, מה שמקשה על זיהוי האותות החלשים המופקים בתגובות בקנה מידה קטן. עם זאת, שימוש במוליך גל במצב אפס מגביל את האור כך שהוא לא יכול להתפשט בתוך מוליך הגל ונפלט רק בכיוון מסוים. זה מאפשר לכידת אותות יעילה הרבה יותר עם אותה כמות אור. כתוצאה מכך, על ידי קיבוע פולימראז האחראי על סינתזת DNA על המשטח התחתון של מוליך הגל ומאפשר סינתזה בזמן אמת של בסיסים המסומנים בפלואורסצנטית, ניתן לנתח את רצף הבסיסים באמצעות זרימה קלושה בלבד שנוצרת במהלך תהליך סינתזת ה-DNA החד-גדילי. שיטה זו מסתמכת על אותות זרימה, כך שההסתברות להתרחשות שגיאות במכשיר הגילוי גבוהה יחסית. עם זאת, שגיאות אלו אינן שגיאות שיטתיות בעלות כיווניות ספציפית; הן מתאימות לשגיאות אקראיות שניתן לתקן סטטיסטית באמצעות מדידות חוזרות. יתר על כן, קלות ההקבלה שלה מאפשרת ניתוח סימולטני בקנה מידה גדול, מה שמאפשר מהירויות קריאת רצפי בסיסים גבוהות מאוד.
השיטה השנייה כוללת קיבוע מולקולות DNA ולאחר מכן מנהור אלקטרונים דרכן כדי למדוד את ספקטרום אנרגיית המנהור המתאים לסוג הבסיס, בדומה לעיקרון המיושם במיקרוסקופי מנהור סורק. טכנולוגיה זו אינה דורשת את תהליך שכפול ה-DNA, ומאפשרת קריאת גדילים ארוכים מאוד במצב של מולקולה בודדת בבת אחת. היא גם כמעט ואינה דורשת טיפול מקדים, מה שמבטיח תיאורטית הפחתות משמעותיות בעלויות הניתוח. עם זאת, עדיין נחשב מוקדם מדי להמשך מחקר בקנה מידה מלא באופן פעיל, מכיוון שדיוק טכני ויציבות מספיקים טרם הושגו, ואתגרים רבים נותרו, כולל פתרון רעש אלקטרוני והבטחת שחזור המכשיר.
השיטה השלישית כוללת מדידת פוטנציאל הממברנה, המשתנה בהתאם לסוג הבסיס, כאשר גדיל DNA בודד עובר דרך חלבון ממברנה מיקרוביאלי. לאחר הפרדת גדיל ה-DNA הכפול לגדיל בודד, העברתו דרך ננו-נקבובית המכילה את חלבון הממברנה גורמת לשינויים חשמליים שונים בעדינות בכל בסיס. אלה מומרים לאותות חשמליים מדויקים כדי לפרש את רצף הבסיסים. טכנולוגיה זו מציעה את היתרון של מבנה פשוט, המקל על מזעור הציוד. כמו השיטה השנייה, היא יכולה לקרוא גדילי DNA ארוכים ברציפות מכיוון שהיא אינה דורשת שכפול. כיום, מתקיים מחקר פעיל לשיפור הדיוק האנליטי על ידי שימוש במדיות או זרזים שונים כדי לשלוט במהירות שבה DNA עובר דרך ננו-נקבובית החלבון.
השיטה האחרונה כוללת מדידת האותות החשמליים הייחודיים הנוצרים על ידי כל בסיס כאשר ה-DNA עובר דרך נקבוביות צרות ביותר המורכבות ממוליך וחומר דיאלקטרי כדי לקבוע את רצף הבסיסים. שיטה זו שונה מהשיטה השלישית, המשתמשת בחלבוני ממברנה מיקרוביאליים, מכיוון שהיא משתמשת בננו-נקבובית מוצקה מבוססת מוליכים למחצה. שימוש בהתקני מוליכים למחצה מוערך כטכנולוגיה בעלת פוטנציאל להציע את התחרותיות הגבוהה ביותר מבחינת מהירות ועלות, מכיוון שהיא מבטיחה יציבות מבנית ומקלה על ייצור המוני. עם זאת, תהליך היישום בציוד בפועל עומד בפני אתגרים טכניים רבים שיש לפתור, כגון רעש אות מוגבר, סטיות מדידה עקב שינויים בגודל הנקבוביות וקשיים בשליטה על מהירות תנועת ה-DNA. כתוצאה מכך, נותרו מכשולים משמעותיים לפני ההגעה לשלב היישום המעשי.
לפיכך, באמצעות פיתוח טכנולוגי מתמשך וקידמה, הזמן והעלות הנדרשים לניתוח רצפי בסיסים פחתו בהדרגה. משמעות הדבר היא שטכנולוגיית ניתוח רצפי בסיסים, ששימשה בעבר אך ורק למטרות מחקר, הופכת כעת בהדרגה לנגישה ברמה הקרובה לחיי היומיום של אנשים רגילים. בדיקות גנטיות בבדיקות בריאות, המיושמות באופן נרחב כיום, הן דוגמה מצוינת, המאפשרות הערכה מקורבת של ההסתברות לפתח מחלות כמו סרטן על ידי ניתוח רצפי בסיסים. הדוגמה הידועה ביותר היא המקרה של אנג'לינה ג'ולי בשנת 2013, שם עברה כריתת שד מונעת לאחר שנודע לה באמצעות ניתוח גנום שיש לה סבירות גבוהה מאוד לפתח סרטן השד. יתר על כן, טכנולוגיית ריצוף DNA מהיר היא חיונית גם במחקר של מחלות גנטיות נדירות. כדי לחקור מחלות גנטיות ברמת רצף ה-DNA, יש צורך להשיג ולנתח מידע נרחב על רצפי DNA לא רק מהמטופלת עצמה אלא גם מקרוביה. אילו היה לוקח יותר מעשור לרצף DNA של אדם יחיד, כפי שקרה בעידן פרויקט הגנום האנושי, מחקר כזה היה בלתי אפשרי מלכתחילה.
יתר על כן, ריצוף DNA טומן בחובו פוטנציאל ליישומים מגוונים מעבר למחקר, המשתרעים גם בחיי היומיום. לדוגמה, הסטארט-אפ 23andMe מנתח את ה-DNA של לקוחות באמצעות דגימות רוק, ומספק מידע בריאותי בסיסי כגון נשאות למחלות נדירות או הסבירות לפתח הפרעות גנטיות ספציפיות. במקביל, הוא מציע נתונים על הקשר הדוק בין מוצאו של אדם לקבוצות אתניות שונות. בחברה האמריקאית המגוונת מבחינה גזעית, שירותים כאלה זכו לעניין רב, מה שהוביל לצמיחה המהירה של 23andme. הם צברו מידע על רצף ה-DNA של לקוחות רבים, ונתונים אלה שימשו למחקר שלהם או סופקו למוסדות מחקר אחרים.
עד כה, המחקר התמקד בעיקר בפיתוח טכנולוגיות לניתוח רצפי DNA במהירות ובדייקנות, ובצבירת כמויות עצומות של נתוני רצפי DNA על סמך זה. עם זאת, כעת הובטחו מספיק דגימות, ואנו מגיעים לרמה טכנולוגית שבה ניתן לנתח ריצוף DNA ברמת הפרט כמעט בזמן אמת. בעוד ששיטות ניתוח מהירות ומדויקות יותר נותרות חשובות והמחקר שלהן אינו הופך לחסר משמעות, המשימה הקריטית יותר בהמשך היא לחקור כיצד להשתמש באופן משמעותי בנתוני רצף DNA של בני אדם, בעלי חיים ופתוגנים, שניתן להשיג בקלות ובמהירות בכל עת ובכל מקום. כיוון אחד יכול להיות פיתוח שירותים הפונים לתחומי העניין של אנשים, כמו 23andMe. פוטנציאל היישום בבריאות הציבור הוא גם עצום, כגון ניתוח מאפייני מחלות ודפוסי התפשטות על סמך מוטציות פתוגנים. מה שברור הוא שעתיד ניתוח הריצוף יונע לא רק על ידי שיפורים במהירות הטכנולוגית, אלא גם על ידי רעיונות חדשים כיצד להשתמש באופן חדשני בנתונים שנצברו.
