Šiame tinklaraščio įraše nagrinėjama, kaip trečiosios kartos sekvenavimas, įveikdamas esamų technologijų apribojimus, leidžia greitai ir tiksliai sekvenuoti asmeninį genomą ir paskatino perėjimą prie personalizuotos ir nuspėjamosios medicinos.
Žmogaus gimimas prasideda tuo metu, kai apvaisintas kiaušinėlis pradeda dalytis po to, kai susijungia spermatozoidas ir kiaušinėlis. Ląstelėms dalijantis, jų skaičius palaipsniui didėja. Kiekviena ląstelė diferencijuojasi, kad atliktų skirtingas funkcijas, galiausiai išaugdama į visavertį organizmą, kuris įgalina mūsų dabartinę gyvybinę veiklą. Šiame etape, kokią funkciją atliks kiekviena ląstelė, lemia genai. Šie genai yra saugomi DNR – genetinėje medžiagoje, kuri koduoja informaciją per specifines pasikartojančias keturių nukleotidų sekas. Mokslininkai stengėsi tiksliai nustatyti šią nukleotidų seką, o tai baigėsi Žmogaus genomo projektu (HGP), kurio tikslas buvo iššifruoti visą žmogaus DNR seką. Atsižvelgiant į to meto technologines galimybes, šio didžiulio projekto užbaigimas užtruko ilgus 13 metų. Taip buvo todėl, kad, nepaisant to, kad žmogaus DNR sudarė maždaug 3 milijardai bazinių porų, tuo metu turėta technologija galėjo nuskaityti tik trumpus, maždaug 300 bazinių porų, ruožus. Galiausiai tam reikėjo sudėtingo proceso: DNR supjaustyti į nesuskaičiuojamą daugybę fragmentų, kiekvieną fragmentą replikuoti, kad būtų galima išanalizuoti jo seką, o tada šiuos fragmentus vėl surinkti į vieną ištisinę seką.
Per visus 13 HGP gyvavimo metų nuolat buvo keliamas greitesnių ir efektyvesnių sekoskaitos metodų poreikis, ir tyrimai, skirti patenkinti šį poreikį, buvo tęsiami nesiliaujant. Dėl to buvo sukurti įvairūs patobulinti metodai. Buvo stengiamasi padidinti greitį, sumažinant DNR replikacijai reikalingą laiką arba didinant įrangos efektyvumą, išlaikant pagrindinį eksperimentinį metodą. Tačiau vien šie patobulinimai turėjo apribojimų, nes ženkliai sumažino bazinės sekos analizei reikalingą laiką. Galiausiai reikėjo iš esmės pakeisti patį eksperimentinį metodą.
Dėl šios paklausos pirmoji pristatyta technologija buvo naujos kartos sekvenavimas (NGS). Nors NGS iš esmės taiko panašų bazių sekų skaitymo principą kaip ir įprasti metodai, analizės laikas žymiai sutrumpėjo, nes DNR buvo padalinta į trumpesnius fragmentus ir šie fragmentai vienu metu buvo nuskaitomi didelio masto lygiagretaus apdorojimo būdu. Ši technologija tapo įmanoma dėl didelio skaičiavimo galios padidėjimo, tačiau ji taip pat turėjo apribojimų – iš dalies išliko ilgi išankstinio apdorojimo etapai ir didelis klaidų lygis, kurie buvo esamų analizės metodų trūkumai. Dėl šios priežasties dabar kuriamos technologijos, kurios naudoja visiškai skirtingus principus nei įprasti metodai, leidžiančius greitai ir labai tiksliai nuskaityti ilgas bazių sekas vienu kartu. Šios technologijos vadinamos trečios kartos sekvenavimo metodais ir bendrai vadinamos vienos molekulės realaus laiko sekvenavimu (SMRT).
Šiuo metu kuriama SMRT technologija skirstoma į keturis pagrindinius metodus. Pirmasis metodas naudoja mažytę liuminescenciją, skleidžiamą fluorescenciškai pažymėtų bazių jungimosi metu DNR sintezės metu. Paprastai cheminių reakcijų skleidžiama šviesa sklaidosi keliomis kryptimis, todėl sunku aptikti silpnus signalus, susidarančius mažo masto reakcijose. Tačiau naudojant nulinio režimo bangolaidį, šviesa sulaikoma, kad ji negalėtų sklisti bangolaidžio viduje ir būtų skleidžiama tik tam tikra kryptimi. Tai leidžia daug efektyviau užfiksuoti signalą naudojant tą patį šviesos kiekį. Todėl imobilizavus polimerazę, atsakingą už DNR sintezę, bangolaidžio apatiniame paviršiuje ir įgalinus fluorescenciškai pažymėtų bazių sintezę realiuoju laiku, tampa įmanoma analizuoti bazių seką naudojant tik silpną liuminescenciją, susidariusią vienos grandinės DNR sintezės proceso metu. Šis metodas remiasi liuminescencijos signalais, todėl klaidų atsiradimo tikimybė aptikimo įrenginyje yra gana didelė. Tačiau šios paklaidos nėra sisteminės paklaidos su konkrečia kryptimi; jos atitinka atsitiktines paklaidas, kurias galima statistiškai ištaisyti atliekant pakartotinius matavimus. Be to, paprastas lygiagretinimas leidžia atlikti didelio masto vienalaikę analizę, leidžiančią labai greitai nuskaityti bazių seką.
Antrasis metodas apima DNR molekulių fiksavimą ir elektronų tuneliavimą per jas, siekiant išmatuoti tuneliavimo energijos spektrą, atitinkantį bazės tipą, panašiai kaip principas, taikomas skenuojančiuose tuneliniuose mikroskopuose. Šiai technologijai nereikia DNR replikacijos proceso, todėl galima vienu metu nuskaityti labai ilgas vienos molekulės būsenos grandines. Jai taip pat beveik nereikia išankstinio apdorojimo, todėl teoriškai tai žada reikšmingą analizės sąnaudų sumažėjimą. Tačiau vis dar laikoma per anksti aktyviai tęsti plataus masto tyrimus, nes dar nepasiektas pakankamas techninis tikslumas ir stabilumas, be to, išlieka daug iššūkių, įskaitant elektroninio triukšmo sprendimą ir įrenginio atkuriamumo užtikrinimą.
Trečiasis metodas apima membranos potencialo matavimą, kuris kinta priklausomai nuo bazės tipo, kai DNR viena grandinė praeina pro mikrobinį membraninį baltymą. Atskyrus DNR dvigubą grandinę į vieną grandinę, jos perleidimas per nanoporą, kurioje yra membraninis baltymas, sukelia šiek tiek skirtingus elektros pokyčius kiekvienoje bazėje. Šie pokyčiai paverčiami tiksliais elektriniais signalais, skirtais bazių sekai interpretuoti. Ši technologija siūlo paprastos struktūros pranašumą, kuris palengvina įrangos miniatiūrizavimą. Kaip ir antrasis metodas, ji gali nuolat nuskaityti ilgas DNR grandines, nes jai nereikia replikacijos. Šiuo metu atliekami aktyvūs tyrimai, siekiant padidinti analitinį tikslumą, naudojant įvairias terpes ar katalizatorius, kad būtų galima kontroliuoti DNR praėjimo per baltymo nanoporą greitį.
Paskutinis metodas apima unikalių elektrinių signalų, kuriuos generuoja kiekviena bazė, matavimą, kai DNR praeina per itin siaurą porą, sudarytą iš laidininko ir dielektriko, siekiant nustatyti bazių seką. Šis metodas skiriasi nuo trečiojo metodo, kuriame naudojami mikrobiniai membraniniai baltymai, nes jame naudojama puslaidininkių pagrindu pagaminta kietoji nanopora. Puslaidininkinių įtaisų naudojimas vertinamas kaip technologija, turinti potencialą pasiūlyti didžiausią konkurencingumą greičio ir kainos atžvilgiu, nes ji užtikrina struktūrinį stabilumą ir palengvina masinę gamybą. Tačiau šio metodo įdiegimo į realią įrangą procesas susiduria su daugybe techninių iššūkių, kuriuos reikia išspręsti, pavyzdžiui, padidėjęs signalo triukšmas, matavimo nuokrypiai dėl porų dydžio pokyčių ir sunkumai kontroliuojant DNR judėjimo greitį. Todėl prieš pasiekiant praktinio pritaikymo etapą lieka didelių kliūčių.
Taigi, nuolat tobulėjant technologijoms ir tobulėjant, bazių sekos analizei reikalingas laikas ir sąnaudos palaipsniui mažėjo. Tai reiškia, kad bazių sekos analizės technologija, anksčiau naudota tik tyrimų tikslais, dabar pamažu tampa prieinama kasdieniame gyvenime. Genetiniai sveikatos patikrinimai, plačiai taikomi šiandien, yra puikus pavyzdys, leidžiantis apytiksliai įvertinti ligų, tokių kaip vėžys, išsivystymo tikimybę analizuojant bazių sekas. Plačiausiai žinomas pavyzdys yra Angelinos Jolie atvejis 2013 m., kai jai buvo atlikta prevencinė mastektomija, genomo analizės metu sužinojus, kad jai yra labai didelė krūties vėžio išsivystymo tikimybė. Be to, greito DNR sekos nustatymo technologija taip pat yra labai svarbi tiriant retas genetines ligas. Norint tirti genetines ligas DNR sekos lygmeniu, būtina gauti ir išanalizuoti išsamią DNR sekos informaciją ne tik iš paties paciento, bet ir iš jo artimų giminaičių. Jei vieno žmogaus DNR sekvenavimas būtų užtrukęs daugiau nei dešimtmetį, kaip tai buvo daroma Žmogaus genomo projekto eroje, tokie tyrimai būtų buvę neįmanomi nuo pat pradžių.
Be to, DNR sekoskaita turi potencialo įvairiems pritaikymams ne tik mokslinių tyrimų srityje, bet ir kasdieniame gyvenime. Pavyzdžiui, startuolis „23andMe“ analizuoja klientų DNR naudodamas seilių mėginius ir pateikia pagrindinę informaciją apie sveikatą, pavyzdžiui, retų ligų nešiotojo statusą arba tikimybę susirgti specifiniais genetiniais sutrikimais. Tuo pačiu metu jis pateikia duomenis apie tai, kaip glaudžiai individo protėviai susiję su įvairiomis etninėmis grupėmis. Rasiškai įvairioje Amerikos visuomenėje tokios paslaugos sulaukė didelio susidomėjimo, todėl „23andme“ sparčiai augo. Jie sukaupė daugybės klientų DNR sekos informaciją, o šie duomenys buvo naudojami jų pačių tyrimams arba teikiami kitoms tyrimų įstaigoms.
Iki šiol tyrimai daugiausia buvo skirti technologijų, skirtų greitai ir tiksliai analizuoti DNR sekas, kūrimui ir didžiulių DNR sekos duomenų kaupimui remiantis tuo. Tačiau dabar surinkta pakankamai mėginių ir pasiekiame technologinį lygį, kai individualaus lygio DNR sekos nustatymą galima analizuoti beveik realiuoju laiku. Nors greitesni ir tikslesni analizės metodai išlieka svarbūs ir jų tyrimai netampa beprasmiai, svarbesnė užduotis ateityje yra ištirti, kaip prasmingai panaudoti žmonių, gyvūnų ir patogenų DNR sekos duomenis, kuriuos galima lengvai ir greitai gauti bet kada ir bet kur. Viena iš krypčių galėtų būti paslaugų, kurios atitiktų žmonių interesus, pavyzdžiui, „23andMe“, kūrimas. Taikymo visuomenės sveikatos srityje potencialas taip pat yra didžiulis, pavyzdžiui, ligų charakteristikų ir plitimo modelių analizė remiantis patogenų mutacijomis. Akivaizdu, kad sekos analizės ateitį lems ne tik technologinio greičio gerinimas, bet ir naujos idėjos, kaip novatoriškai panaudoti sukauptus duomenis.
