Tento blogový príspevok skúma, ako sekvenovanie tretej generácie, prekonávajúc obmedzenia existujúcich technológií, umožňuje rýchle a presné sekvenovanie osobného genómu a viedla k posunu smerom k personalizovanej a prediktívnej medicíne.
Zrodenie ľudského jedinca začína momentom, keď sa oplodnené vajíčko začne deliť po spojení spermie a vajíčka. Ako sa bunky delia, ich počet sa postupne zvyšuje. Každá bunka sa diferencuje, aby vykonávala odlišné funkcie a nakoniec sa z nej vytvorí kompletný organizmus, ktorý umožňuje naše súčasné životné aktivity. V tomto štádiu je funkcia, ktorú bude každá bunka vykonávať, určená génmi. Tieto gény sú uložené v DNA, genetickom materiáli, ktorý kóduje informácie prostredníctvom špecifických opakujúcich sa sekvencií štyroch nukleotidov. Vedci sa snažili presne zmapovať túto nukleotidovú sekvenciu, čo vyvrcholilo Projektom ľudského genómu (HGP), ktorého cieľom bolo dekódovať celú sekvenciu ľudskej DNA. Vzhľadom na technologické možnosti tej doby trvalo dokončenie tohto rozsiahleho projektu dlhých 13 rokov. Bolo to preto, že napriek tomu, že ľudská DNA pozostávala z približne 3 miliárd párov báz, vtedy dostupná technológia dokázala čítať iba krátke úseky s približne 300 pármi báz naraz. Nakoniec si to vyžadovalo zložitý proces: rozrezanie DNA na nespočetné množstvo fragmentov, replikáciu každého fragmentu na analýzu jeho sekvencie a následné opätovné zostavenie týchto fragmentov do jednej súvislej sekvencie.
Počas 13-ročného trvania HGP sa neustále zdôrazňovala potreba rýchlejších a efektívnejších metód sekvenovania a výskum na uspokojenie tohto dopytu pokračoval nezmenenou silou. V dôsledku toho boli vyvinuté rôzne vylepšené techniky. Vynakladalo sa úsilie na zvýšenie rýchlosti skrátením času potrebného na replikáciu DNA alebo zvýšením efektívnosti zariadení pri zachovaní základného experimentálneho prístupu. Tieto vylepšenia však samy o sebe mali obmedzenia v dramatickom skrátení času potrebného na analýzu sekvencií báz. Nakoniec bola nevyhnutná zásadná zmena samotnej experimentálnej metódy.
Uprostred tohto dopytu bola prvou zavedenou technológiou sekvenovanie novej generácie (NGS). Hoci NGS v podstate zdieľa podobný princíp čítania sekvencií báz s konvenčnými metódami, výrazne skrátil čas analýzy rozdelením DNA na kratšie fragmenty a využitím rozsiahleho paralelného spracovania na súčasné čítanie týchto fragmentov. Táto technológia sa stala možnou vďaka dramatickému zlepšeniu výpočtového výkonu, ale niesla aj obmedzenie v podobe čiastočného zachovania dlhých krokov predspracovania a vysokej chybovosti, ktoré boli nevýhodami existujúcich analytických metód. Z tohto dôvodu sa teraz vyvíjajú technológie, ktoré využívajú úplne odlišné princípy od konvenčných metód, čo umožňuje rýchle a vysoko presné čítanie dlhých sekvencií báz v jednom kroku. Tieto technológie sa označujú ako metódy sekvenovania tretej generácie a súhrnne sa nazývajú sekvenovanie jednej molekuly v reálnom čase (SMRT).
Technológia SMRT, ktorá je v súčasnosti vo vývoji, sa všeobecne delí na štyri hlavné prístupy. Prvá metóda využíva nepatrnú luminiscenciu emitovanú pri väzbe fluorescenčne značených báz počas syntézy DNA. Svetlo emitované chemickými reakciami sa zvyčajne rozptyľuje do viacerých smerov, čo sťažuje detekciu slabých signálov produkovaných pri reakciách v malom meradle. Použitie vlnovodu s nulovým módom však obmedzuje svetlo, takže sa nemôže šíriť vo vlnovode a je emitované iba v určitom smere. To umožňuje oveľa efektívnejšie zachytávanie signálu s rovnakým množstvom svetla. V dôsledku toho, imobilizáciou polymerázy zodpovednej za syntézu DNA na spodnom povrchu vlnovodu a umožnením syntézy fluorescenčne značených báz v reálnom čase, je možné analyzovať sekvenciu báz iba pomocou slabej luminiscencie generovanej počas procesu syntézy jednovláknovej DNA. Táto metóda sa spolieha na luminiscenčné signály, takže pravdepodobnosť výskytu chýb v detekčnom zariadení je relatívne vysoká. Tieto chyby však nie sú systematickými chybami so špecifickou smerovosťou; zodpovedajú náhodným chybám, ktoré je možné štatisticky korigovať opakovanými meraniami. Okrem toho, jednoduchosť paralelizácie umožňuje simultánnu analýzu vo veľkom meradle, čo umožňuje veľmi rýchle rýchlosti čítania sekvencií báz.
Druhá metóda zahŕňa fixáciu molekúl DNA a následné tunelovanie elektrónov cez ne s cieľom zmerať energetické spektrum tunelovania zodpovedajúce typu bázy, podobne ako princíp používaný v skenovacích tunelových mikroskopoch. Táto technológia nevyžaduje proces replikácie DNA, čo umožňuje čítanie veľmi dlhých vlákien v stave jednej molekuly naraz. Taktiež nevyžaduje takmer žiadnu predbežnú úpravu, čo teoreticky sľubuje významné zníženie nákladov na analýzu. Stále sa však považuje za predčasné na aktívne pokračovanie výskumu v plnom rozsahu, pretože ešte nebola dosiahnutá dostatočná technická presnosť a stabilita a pretrváva množstvo výziev vrátane riešenia elektronického šumu a zabezpečenia reprodukovateľnosti zariadenia.
Tretia metóda zahŕňa meranie membránového potenciálu, ktorý sa mení v závislosti od typu bázy, keď jednovláknová DNA prechádza cez mikrobiálny membránový proteín. Po oddelení dvojvláknovej DNA na jednovláknovú, jej prechod cez nanopór obsahujúci membránový proteín spôsobuje jemne odlišné elektrické zmeny na bázu. Tieto sa premieňajú na presné elektrické signály na interpretáciu sekvencie báz. Táto technológia ponúka výhodu jednoduchej štruktúry, ktorá uľahčuje miniaturizáciu zariadení. Podobne ako druhá metóda, dokáže čítať dlhé vlákna DNA nepretržite, pretože nevyžaduje replikáciu. V súčasnosti prebieha aktívny výskum zameraný na zvýšenie analytickej presnosti využitím rôznych médií alebo katalyzátorov na riadenie rýchlosti, akou DNA prechádza cez nanopór proteínu.
Posledná metóda zahŕňa meranie jedinečných elektrických signálov generovaných každou bázou, keď DNA prechádza extrémne úzkym pórom zloženým z vodiča a dielektrika na určenie sekvencie báz. Táto metóda sa líši od tretej metódy, ktorá využíva mikrobiálne membránové proteíny, pretože využíva pevný nanopór na báze polovodiča. Využitie polovodičových zariadení sa hodnotí ako technológia s potenciálom ponúknuť najvyššiu konkurencieschopnosť z hľadiska rýchlosti a nákladov, pretože zaisťuje štrukturálnu stabilitu a uľahčuje hromadnú výrobu. Proces implementácie do reálnych zariadení však čelí mnohým technickým výzvam, ktoré je potrebné vyriešiť, ako je zvýšený šum signálu, odchýlky merania v dôsledku zmien veľkosti pórov a ťažkosti s riadením rýchlosti pohybu DNA. V dôsledku toho zostávajú pred dosiahnutím fázy praktického použitia značné prekážky.
Vďaka neustálemu technologickému vývoju a pokroku sa tak čas a náklady potrebné na analýzu sekvencií báz postupne znižujú. To znamená, že technológia analýzy sekvencií báz, ktorá sa kedysi používala výlučne na výskumné účely, sa teraz postupne stáva dostupnou na úrovni blízkej každodennému životu bežných ľudí. Genetické testovanie v rámci zdravotných prehliadok, ktoré sa dnes bežne používa, je ukážkovým príkladom a umožňuje približný odhad pravdepodobnosti vzniku ochorení, ako je rakovina, analýzou sekvencií báz. Najznámejším príkladom je prípad Angeliny Jolie z roku 2013, keď podstúpila preventívnu mastektómiu po tom, čo sa prostredníctvom analýzy genómu dozvedela, že má veľmi vysokú pravdepodobnosť vzniku rakoviny prsníka. Okrem toho je technológia rýchleho sekvenovania DNA kľúčová aj pri výskume zriedkavých genetických ochorení. Na štúdium genetických ochorení na úrovni sekvencií DNA je potrebné získať a analyzovať rozsiahle informácie o sekvenciách DNA nielen od samotného pacienta, ale aj od jeho blízkych príbuzných. Ak by sekvenovanie DNA jednej osoby trvalo viac ako desaťročie, ako to bolo v ére Projektu ľudského genómu, takýto výskum by bol od začiatku nemožný.
Okrem toho má sekvenovanie DNA potenciál pre rôzne aplikácie nad rámec výskumu a siaha do každodenného života. Napríklad startup 23andMe analyzuje DNA zákazníkov pomocou vzoriek slín a poskytuje základné zdravotné informácie, ako je napríklad stav nositeľa zriedkavých chorôb alebo pravdepodobnosť vzniku špecifických genetických porúch. Zároveň ponúka údaje o tom, ako úzko je pôvod jednotlivca spojený s rôznymi etnickými skupinami. V rasovo rozmanitej americkej spoločnosti si takéto služby získali značný záujem, čo viedlo k rýchlemu rastu spoločnosti 23andme. Zhromaždili informácie o sekvencii DNA nespočetných zákazníkov a tieto údaje použili na vlastný výskum alebo poskytli iným výskumným inštitúciám.
Doteraz sa výskum zameriaval predovšetkým na vývoj technológií na rýchlu a presnú analýzu sekvencií DNA a na zhromažďovanie obrovského množstva údajov o sekvenciách DNA na základe týchto údajov. Teraz však bolo zabezpečených dostatok vzoriek a dosahujeme technologickú úroveň, kde je možné sekvenovanie DNA na individuálnej úrovni analyzovať takmer v reálnom čase. Hoci rýchlejšie a presnejšie analytické metódy zostávajú dôležité a ich výskum nie je zbavený zmyslu, dôležitejšou úlohou do budúcnosti je preskúmať, ako zmysluplne využiť údaje o sekvenciách DNA ľudí, zvierat a patogénov, ktoré je možné ľahko a rýchlo získať kedykoľvek a kdekoľvek. Jedným zo smerov by mohol byť vývoj služieb, ktoré oslovujú záujmy ľudí, ako napríklad 23andMe. Potenciál pre uplatnenie vo verejnom zdravotníctve je tiež obrovský, napríklad analýza charakteristík chorôb a vzorcov šírenia na základe mutácií patogénov. Je jasné, že budúcnosť sekvenčnej analýzy bude poháňaná nielen zlepšením technologickej rýchlosti, ale aj novými nápadmi, ako inovatívne využiť nahromadené údaje.
