Овај блог пост истражује како секвенцирање треће генерације, превазилазећи ограничења постојећих технологија, омогућава брзо и прецизно секвенцирање личног генома и покреће прелазак на персонализовану и предиктивну медицину.
Рођење људске јединке почиње тренутком када оплођена јајна ћелија започне деобу ћелија након што се сперматозоид и јајна ћелија сједине. Како се ћелије деле, њихов број постепено расте. Свака ћелија се диференцира да би обављала различите функције, на крају прерастајући у комплетан организам који омогућава наше тренутне животне активности. У овој фази, коју функцију ће свака ћелија обављати одређују гени. Ови гени су смештени у ДНК, генетском материјалу, који кодира информације кроз специфичне понављајуће секвенце од четири нуклеотида. Научници су се трудили да прецизно мапирају ову нуклеотидну секвенцу, што је кулминирало Пројектом људског генома (HGP), који је имао за циљ декодирање целе секвенце људске ДНК. С обзиром на технолошке могућности тог времена, завршетак овог масивног пројекта трајао је дугих 13 година. То је било зато што је, упркос томе што се људска ДНК састојала од приближно 3 милијарде базних парова, технологија која је тада била доступна могла да чита само кратке делове од око 300 базних парова одједном. На крају крајева, то је захтевало сложен процес: сечење ДНК на безброј фрагмената, репликацију сваког фрагмента ради анализе његове секвенце, а затим поновно састављање ових фрагмената у једну континуирану секвенцу.
Током 13-годишњег трајања HGP-а, потреба за бржим и ефикаснијим методама секвенцирања стално је истицана, а истраживања како би се задовољила ова потражња су се несмањено настављала. Као резултат тога, развијене су разне побољшане технике. Уложени су напори да се повећа брзина смањењем времена потребног за репликацију ДНК или побољшањем ефикасности опреме, уз задржавање основног експерименталног приступа. Међутим, сама ова побољшања имала су ограничења у драматичном смањењу времена потребног за анализу базних секвенци. На крају крајева, била је неопходна фундаментална промена у самој експерименталној методи.
Усред ове потражње, прва представљена технологија била је секвенцирање следеће генерације (NGS). Иако NGS у основи дели сличан принцип за читање базних секвенци са конвенционалним методама, значајно је скратио време анализе дељењем ДНК на краће фрагменте и коришћењем паралелног приступа обраде великих размера за истовремено читање ових фрагмената. Ова технологија је постала могућа захваљујући драматичном побољшању рачунарске снаге, али је такође носила ограничење делимичног задржавања дугих корака претходних обрада и високих стопа грешака, што су били недостаци постојећих метода анализе. Из тог разлога, сада се развијају технологије које користе потпуно другачије принципе од конвенционалних метода, омогућавајући брзо и веома прецизно читање дугих базних секвенци у једном пролазу. Ове технологије се називају методама секвенцирања треће генерације и заједнички се називају секвенцирање једног молекула у реалном времену (SMRT).
SMRT технологија која је тренутно у развоју је широко категорисана у четири главна приступа. Прва метода користи ситну луминесценцију која се емитује када се флуоресцентно обележене базе вежу током синтезе ДНК. Типично, светлост емитована из хемијских реакција се расејава у више праваца, што отежава детекцију слабих сигнала произведених у реакцијама малог обима. Међутим, коришћење таласовода нултог мода ограничава светлост тако да се она не може ширити унутар таласовода и емитује се само у одређеном правцу. Ово омогућава много ефикасније хватање сигнала са истом количином светлости. Сходно томе, имобилизацијом полимеразе одговорне за синтезу ДНК на доњој површини таласовода и омогућавањем синтезе флуоресцентно обележених база у реалном времену, постаје могуће анализирати секвенцу база користећи само слабу луминесценцију генерисану током процеса синтезе једноланчане ДНК. Ова метода се ослања на сигнале луминесценције, тако да је вероватноћа грешака које се јављају у уређају за детекцију релативно висока. Међутим, ове грешке нису систематске грешке са одређеном усмереношћу; оне одговарају случајним грешкама које се могу статистички исправити поновљеним мерењима. Штавише, лакоћа паралелизације омогућава симултану анализу великих размера, што омогућава веома велике брзине очитавања секвенци база.
Друга метода укључује фиксирање молекула ДНК, а затим тунелирање електрона кроз њих како би се измерио енергетски спектар тунелирања који одговара типу базе, слично принципу који се примењује у скенирајућим тунелским микроскопима. Ова технологија не захтева процес репликације ДНК, што омогућава очитавање веома дугих ланаца у стању једног молекула одједном. Такође, готово да не захтева претходну обраду, теоретски обећавајући значајно смањење трошкова анализе. Међутим, још увек се сматра преурањеним за активан наставак истраживања у пуном обиму, јер још увек нису постигнуте довољна техничка прецизност и стабилност, а бројни изазови остају, укључујући решавање електронског шума и обезбеђивање репродуктивности уређаја.
Трећа метода укључује мерење мембранског потенцијала, који варира у зависности од типа базе, док једноланчана ДНК пролази кроз мембрански протеин микроба. Након раздвајања дволанчане ДНК у једноланчану, њено пропуштање кроз нанопору која садржи мембрански протеин изазива суптилно различите електричне промене по бази. Оне се претварају у прецизне електричне сигнале за тумачење базне секвенце. Ова технологија нуди предност једноставне структуре, што олакшава минијатуризацију опреме. Као и друга метода, може континуирано да чита дугачке ланце ДНК јер не захтева репликацију. Тренутно су у току активна истраживања за побољшање аналитичке тачности коришћењем различитих медија или катализатора за контролу брзине којом ДНК пролази кроз нанопору протеина.
Коначна метода укључује мерење јединствених електричних сигнала које генерише свака база док ДНК пролази кроз изузетно уску пору састављену од проводника и диелектрика да би се одредила секвенца база. Ово се разликује од треће методе, која користи протеине микробних мембрана, јер користи чврсту нанопору засновану на полупроводнику. Коришћење полупроводничких уређаја се процењује као технологија са потенцијалом да понуди највећу конкурентност у погледу брзине и трошкова, јер обезбеђује структурну стабилност и олакшава масовну производњу. Међутим, процес имплементације овога у стварну опрему суочава се са бројним техничким изазовима које је потребно решити, као што су повећана бука сигнала, одступања мерења услед промена величине пора и потешкоће у контроли брзине кретања ДНК. Сходно томе, остају значајне препреке пре него што се стигне до фазе практичне примене.
Дакле, кроз континуирани технолошки развој и напредак, време и трошкови потребни за анализу базних секвенци постепено су се смањивали. То значи да технологија анализе базних секвенци, некада коришћена искључиво у истраживачке сврхе, сада постепено постаје доступна на нивоу блиском свакодневном животу обичних људи. Генетско тестирање у здравственим прегледима, које се данас широко примењује, одличан је пример, омогућавајући приближну процену вероватноће развоја болести попут рака анализом базних секвенци. Најпознатији пример је случај Анђелине Џоли из 2013. године, где је подвргнута превентивној мастектомији након што је кроз анализу генома сазнала да има веома велику вероватноћу развоја рака дојке. Штавише, технологија брзог секвенцирања ДНК је такође кључна у истраживању ретких генетских болести. Да би се проучавале генетске болести на нивоу ДНК секвенце, неопходно је добити и анализирати опсежне информације о ДНК секвенци не само од самог пацијента већ и од његових блиских рођака. Да је требало више од деценије да се секвенцира ДНК једне особе, као што је то било током ере Пројекта људског генома, такво истраживање би било немогуће од самог почетка.
Штавише, секвенцирање ДНК има потенцијал за разноврсне примене ван истраживања, протежући се у свакодневни живот. На пример, стартап 23andMe анализира ДНК купаца користећи узорке пљувачке, пружајући основне здравствене информације као што је статус носиоца ретких болести или вероватноћа развоја специфичних генетских поремећаја. Истовремено, нуди податке о томе колико је порекло појединца повезано са различитим етничким групама. У расно разноликом америчком друштву, такве услуге су изазвале значајно интересовање, што је довело до брзог раста 23andme-а. Акумулирали су информације о секвенци ДНК безброј купаца, а ове податке су користили за сопствена истраживања или достављали другим истраживачким институцијама.
До сада су се истраживања првенствено фокусирала на развој технологија за брзу и прецизну анализу ДНК секвенци и акумулирање огромних количина података о ДНК секвенцама на основу тога. Међутим, сада је обезбеђено довољно узорака и достижемо технолошки ниво где секвенцирање ДНК на индивидуалном нивоу може анализирати готово у реалном времену. Иако брже и прецизније методе анализе остају важне и њихово истраживање није обесмишљено, критичнији задатак у будућности је истраживање како смислено искористити податке о ДНК секвенцама људи, животиња и патогена који се могу лако и брзо добити било када и било где. Један правац би могао бити развој услуга које привлаче интересе људи, попут 23andMe. Потенцијал за примену у јавном здравству је такође огроман, као што је анализа карактеристика болести и образаца ширења на основу мутација патогена. Оно што је јасно јесте да будућност анализе секвенцирања неће бити вођена само побољшањима у технолошкој брзини већ и новим идејама о томе како иновативно искористити акумулиране податке.
